文献题目：

基于脂质纳米颗粒递送系统的mRNA疫苗的细菌内毒素检测方法研究

发表期刊：

《中华微生物学和免疫学杂志》2025年11月

作者团队：

中检院呼吸道病毒疫苗室、珠海丽凡达生物技术有限公司

（图：发表原文）

方法：采用2020年版《中华人民共和国药典》三部中的凝胶限度法，以Ⅱ型单纯疱疹病毒mRNA疫苗、呼吸道合胞病毒mRNA疫苗和带状疱疹mRNA疫苗为检测对象，通过样品稀释倍数和稀释剂的筛选以及干扰试验，确定细菌内毒素检测的适宜条件。

本次方法研究中，使用3777金沙官方VIP认证新酶重组C因子检测试剂盒，对检测结果进行验证。

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LNP-mRNA的结构特殊性

mRNA技术凭借快速设计、生产高效、免疫原性强等优势，在疫苗、肿瘤、传染病、自身免疫性疾病等领域开辟了新路径，新冠mRNA疫苗的紧急使用加速了mRNA技术的临床验证与产业化进程。mRNA通过脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNP)递送到体内发挥作用，LNP通常包含阳离子脂质、胆固醇、磷脂及聚乙二醇化脂质，通过静电吸附作用将核酸包裹在内部。

LNP-mRNA的结构示意图

LNP-mRNA疫苗的主要剂型是注射剂，细菌内毒素是其质量控制的重要检测项之一。细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁的一种组成成分，其分子结构主要包括O抗原、核心多糖和脂质A，内毒素在极微量(1~5ng/kg体重)下便可引起严重不良反应(机体发热反应、败血症、弥漫性血管内凝血、休克死亡等)。LNP是由疏水性脂质自组装而成，内毒素在检测过程中可能通过静电作用和疏水效应与脂质成分结合。研究表明，使用鲎试剂检测脂质体中的内毒素时，内毒素会被脂质体吸附从而干扰检测，通过降低脂质浓度可减少内毒素和脂质的相互作用从而减轻或消除干扰，此外在检测体系中加入镁离子等二价阳离子可能有助于抑制干扰。

内毒素的结构示意图

研究方法与材料

本文部分研究，通过3777金沙官方VIP认证新酶厂家不同批次的重组C因子检测试剂盒，使用解蔽缓冲液和筛选样品稀释倍数，旨在消除LNP对细菌内毒素检测的干扰，建立了适用于LNP-mRNA疫苗的细菌内毒素的检测方法，并对结果进行验证。

· 实验样品：Ⅱ型单纯疱疹病毒mRNA疫苗(HSV-2疫苗）、呼吸道合胞病毒mRNA疫苗(RSV疫苗）、带状疱疹mRNA疫苗(VZV疫苗)，由珠海丽凡达生物技术有限公司提供。

· 试剂：重组C因子试剂盒(检测范围：0.005~5EU/mL，批号HH20250401R、HH20250101R、HH20240601R)，由3777金沙官方VIP认证提供。

· 仪器：SpectraMax i3x荧光微板检测系统。

· 检测方法：

（1）根据公式MVD=cL/λ (c为供试品溶液的浓度，药典规定取值为1.0 mL/mL，L为30EU/mL，λ为标准曲线最低点的浓度，即0.005EU/mL)计算出供试品的MVD为6000倍。根据前期预实验，待测样品使用钙镁离子解蔽缓冲液梯度稀释100倍后使用。

（2）按照重组C因子检测试剂盒说明书，细菌内毒素标准品溶液使用无热原水稀释至5、0.5、0.05、0.005EU/mL，无热原水作为阴性对照。将100μL细菌内毒素标准品溶液、待测样品和阴性对照分别加至96孔板中，每个样品均做2个复孔，再加入100μL底物试剂。仪器参数设置：激发波长380nm，发射波长440nm。在0h和37℃孵育1h后分别检测荧光值，计算0h和1h时间点的荧光差值(ΔRFU)，从细菌内毒素标准品溶液和样品的ΔRFU中减去阴性对照的ΔRFU得到净荧光差值(净ΔRFU)。

（3）数据分析：计算细菌内毒素标准品溶液的净ΔRFU和浓度(EU/mL)的对数，以细菌内毒素工作标准品溶液浓度的对数为横坐标，净ΔRFU的对数为纵坐标进行线性拟合。根据待测样品及加标样品的内毒素浓度计算加标回收率：加标回收率%=(加标内毒素浓度-未加标内毒素浓度)/加标内毒素浓度(0.5EU/mL)*100%。若加标回收率在50%~200%则认为待测样品对检测无干扰，检测结果可靠。

、

· 验证：

（1）标准曲线的可靠性试验：比较同一厂家3个批次试剂盒的标准曲线，按试剂盒方法进行操作，以细菌内毒素标准品溶液浓度的对数为横坐标，净ΔRFU的对数为纵坐标进行线性拟合，当标准曲线的相关系数(R2)≥0.980时标准曲线有效，可根据标准曲线计算样品的内毒素浓度。

（2）样品加标回收率和内毒素检测：取HSV-2、RSV、VZV疫苗各3个批次按重组C因子检测方法进行操作，每批次疫苗配制2组样品，均使用钙镁离子解蔽缓冲液稀释100倍，其中一组作为样品组，另一组样品中加入终浓度为0.5EU/mL(0.5EU/mL为样品稀释后的加标浓度)的细菌内毒素标准品溶液作为加标样品组。根据标准曲线线性拟合方程，计算样品组和加标样品组的细菌内毒素浓度并计算加标回收率，当样品加标回收率在50%~200%范围内，表明样品检测无干扰。最后对加标回收率合格的样品，根据样品稀释倍数计算样品的细菌内毒素含量。

研究成果

同一厂家3个批次试剂盒标准曲线的相关系数(R2)分别为0.999、0.990、0.999，均大于0.980，阴性对照荧光值均低于标准曲线最低浓度点(0.005EU/mL)的荧光值，符合2020版《中国药典》三部通则1143中光度测定法试验有效性的要求，可用于细菌内毒素检查。

HSV-2、RSV、VZV疫苗样品，重组C因子法的内毒素检测结果如下，样品加标回收率在79.5%~102.4%之间，均在50%~200%范围内，样品细菌内毒素浓度均<30EU/mL，与凝胶限度法的检测结果一致。

本研究为LNP-mRNA疫苗的细菌内毒素检测方法的建立提供了有效策略，可有效排除检测干扰以确保检测结果的准确性。随着内毒素检测技术的发展，重组C因子法等新型检测方法可作为现有鲎试剂法的有力补充，为基于LNP递送系统的mRNA疫苗的质量控制提供更全面的保障。

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内容丨研发中心、市场部-生物药

编辑排版丨品牌

审核丨研发中心、市场部

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